Білки: визначення первинної послідовності

Білки: визначення первинної послідовності

Визначення амінокислотної послідовності поліпептидного ланцюга засноване на принципах, які були розвинені Сенгером [Sanger F, 1952]. Вони використовуються і сьогодні, правда зі всілякими варіаціями і вдосконаленнями. Щоб розшифрувати амінокислотнихпослідовність будь-якого полипептида, необхідно здійснити шість основних стадій:

Стадія 1, – визначення амінокислотного складу.

Першим кроком на шляху до розшифровки амінокислотноїпослідовності служить гідроліз всіх пептидних зв’язків чистого поліпептиду. Утвориться суміш амінокислот аналізується потім за допомогою іонообмінної хроматографії. що дозволяє визначити, які амінокислоти і в якому співвідношенні присутні в гидролизате.

Стадія 2, – ідентифікація амино – і карбокси – кінцевих залишків.

Наступний крок полягає в ідентифікації амінокислотного залишку, що знаходиться на кінці поліпептидного ланцюга, несучого вільну альфа-аминогруппу, т. е. на аміноконце (NH2 – кінці, або N-кінці). Для цієї мети Сенгер запропонував використовувати реагент, & lt; 1-фтор-2,4-динітробензол & gt ;, який можна приєднати в якості мітки до аміноконцевому (N – концевому) залишку ланцюга, в результаті чого утворюється забарвлене в жовтий колір 2,4-дінітрофенольное (ДНФ) похідне поліпептиду. При кислотному гідролізі все пептидні зв’язки в такому ДНФ-похідному розщеплюються, однак ковалентний зв’язок між альфа-аміногрупою N-кінцевого залишку і 2,4-дінітрофенільной групою залишається незачепленою. Отже, N-кінцевий залишок буде представлений в гидролизате у вигляді 2,4-дінітрофенільного похідного. Це похідне легко відокремити від незаміщених вільних амінокислот і ідентифікувати хроматографическим способом шляхом порівняння його з аутотентічнимі дінітрофенільнимі похідними різних амінокислот. Карбоксіконцевой (С – кінцевий) амінокислотний залишок теж можна ідентифікувати, використовуючи той чи інший метод. Один з таких методів полягає в інкубуванні полипептида з карбоксипептидази, яка гідролізує тільки пептидную зв’язок що знаходиться на Карбоксильні кінці (С-кінці) ланцюга. Визначивши, яка з амінокислот першої відщепилася від полипептида, при дії на нього карбоксипептидази, можна ідентифікувати С-кінцевий залишок.

У результаті ідентифікації N – і З – кінцевих залишків полипептида отримують дві важливих реперних точки для визначення його амінокислотної послідовності (первинної структури).

Стадія 3, – розщеплення поліпептидного ланцюга на фрагменти.

Береться ще одна порція аналізованого препарату, що містить неушкоджені поліпептидні ланцюги і розщеплюються на дрібніші шматки – короткі пептиди, що складаються в середньому з 10-15 амінокислотних залишків. Найбільш поширений метод для проведення такого розщеплення – це частковий ферментативний гідроліз пептиду під вплиEм травного ферменту трипсину. Цей фермент має високу специфічність дії: гідролізу піддаються тільки ті пептидні зв’язки, які утворені між карбоксильної групою лізину або аргініну і аминогруппой будь амінокислоти. Число дрібних фрагментів, що утворюються під дією тріпcіна, можна, таким чином, передбачити, знаючи загальне число залишків лізину і аргініну в вихідному поліпептиді. При цьому всі дрібні пептиди, крім одного, повинні мати на Карбоксильні кінці залишок лізину або аргініну. Фрагменти, що утворилися під впливом трипсину, розділяють методом іонообмінної хроматографії на колонці, або за допомогою електрофорезу і хроматографії на папері. Часто проводять двовимірне хроматографічне розділення на аркуші паперу, в результаті чого отримують хроматограму з розподілять на ній пептидами у вигляді пептидного карти.

Стадія 4, – визначення послідовності пептидних фрагментів

На цій стадії встановлюється аминокислотная послідовність у кожному з пептидних фрагментів, отриманих на стадії 3. Для цієї мети зазвичай використовують хімічний метод, розроблений Пером Едманом [Edman PV, 1967]. Розщеплення по Едману зводиться до того, що метится і відщепляється тільки N-кінцевий залишок пептиду, а всі інші пептидні зв’язки не зачіпаються. Після ідентифікації отщеплением N – кінцевого залишку мітка вводиться в наступний, що став тепер N – кінцевим, залишок, який точно також відщепляється, проходячи через ту ж серію реакцій. Так, отщепляя залишок за залишком, можна визначити всю амінокислотнихпослідовність пептиду, використовуючи для цієї мети всього одну пробу. У методі Едмана спочатку пептид взаємодіє з фенілізотіоціонатом, який приєднується до вільної альфа-аминогруппе N – кінцевого залишку. Обробка пептиду холодної разбовленной кислотою Пріводіно до отщеплению N – кінцевого залишку у вигляді фенілтіогідантоінового похідного, яке можна ідентифікувати хроматографічними методами. Інша частина пептидного цінуй після видалення N – кінцевого залишку виявляється непошкодженою. Операція повторюється стільки раз скільки залишків містить пептид. Таким способом можна легко визначити амінокислотнихпослідовність пептидів, що містять 10-20 амінокіслоних залишків. Визначення амінокислотної послідовності проводиться для всіх фрагментів, що утворилися під дією трипсину. Після цього виникає наступна проблема, – визначити в якому порядку розташовувалися фрагменти в первісної поліпептидного ланцюга.

Стадія 5, – розщеплення вихідної поліпептидного ланцюга ще одним способом

Щоб встановити порядок розташування пептидних фрагментів, що утворилися під дією трипсину, беруть нову порцію препарату вихідного полипептида і розщеплюють його на більш дрібні фрагменти яким-небудь іншим способом, за допомогою якого розщеплюються пептидні зв’язку стійкі до дії трипсину. Для цієї мети переважніше виявляється не ферментативні, а хімічні методи. Хороші результати дає обробка препарату бромцианом, расщепляющим тільки ті пептидні зв’язки, в яких карбонильная група належить залишку метіоніну. Кожен з отриманих коротких пептидів піддається послідовному розщепленню за методом Едмана (також як на стадії 4) і таким шляхом встановлюють їх амінокислотнихпослідовність.

Стадія 6, – встановлення порядку розташування пептидних фрагментів по перекриваються фрагментам.

Амінокислотні послідовності в пептидних фрагментах, отриманих двома способами, порівнюють, щоб у другому наборі знайти пептиди, в яких послідовності окремих ділянок збігалися б з послідовностями тих чи інших ділянок пептидів першого набору. Пептиди з другого набору з перекриваються ділянками дозволяють з’єднати в правильному порядку пептидні фрагменти, отримані в результаті першого розщеплення вихідної поліпептидного ланцюга.

Іноді другого розщеплення полипептида на фрагменти виявляється недостатньо, для того щоб знайти перекриваються ділянки для всіх пептидів, отриманих після першого розщеплення. В цьому випадку застосовується третій, а іноді і четвертий спосіб розщеплення, щоб отримати зрештою набір пептидів, що забезпечують повне перекривання всіх ділянок і встановлення повної послідовності амінокислот у вихідній поліпептидного ланцюга.

Знаходять:

  • визначення амінокислотної послідовності у поліпептид
  • визначення послидовности аминокислот
  • визначити амінокислотний залишок
  • методи визначення структури білка по сенгару та едману
  • хроматографічне визначення амінокислот
  • що треба знати щоб становити порядок розташування амінокислот у білку
  • як визначит первинну структуру білка
No Video